بهینه سازی شرایط رشد باکتریهای افزایش دهنده رشد گیاه کود زیستی فسفاته بارور 2 در فرمانتور

بهینه سازی شرایط رشد باکتریهای افزایش دهنده رشد گیاه کود زیستی فسفاته بارور 2 در فرمانتور

بهینه سازی شرایط رشد باکتریهای افزایش دهنده رشد گیاه کود زیستی فسفاته بارور 2 در فرمانتور

مقدمه

http://www.ijbio.ir/article_55_dc9fdc251a0dfb6e4bf4001fce9a8c9e.pdf

فسفر یکی از مهمترین عناصر غذایی مورد نیاز برای رشد گیاهان است. این عنصر پس از جذب توسط گیاه، بـرای ساختن تـرکیـبات زیستی مختـلف از جمله، نوکـلئوتیدها، فسفوپروتئینها، فسفولیپیدها، قندهای فسفردار، فیتین وسایر ترکیبات آلی فسفردار جهت انجام اعمال فیزیولوژیک مانند تقسیم سلولی، تشکیل گل، تشکیل و رسیدن میوه و دانه، تنفس سلولی، رشد و تکامل ریشه خصوصاً ریشه های فرعی و مویین، بلوغ گیاه، مقاومت در برابر بیماریها، فتوسنتز و رشد کلی گیاه و به صورت اشکال معدنی فسفر، مانند یونهای HPO42- وH2PO4-  ، در تنظیم pH محیط داخلی سلولها استفاده می شود (9 و 13). این عنصر غذایی پر اهمیت، در بسیاری از خاکها به اندازه کافی در دسترس گیاه نمی باشد. کمبود میزان فسفات قابل دستیابی توسط گیاهان در بسیاری از خاکها، یکی از عوامل محدود کننده رشد گیاهان  است که باید برطرف شود (4، 12 و 15).

میکروارگانیسمهایی که بر روی مواد آلی آزاد شده از ریشه زندگی می کنند، با ترشح اسیدهای مختلف و کـاهش pH محیط ریـشه، بـاعث افزایـش غلظت فسفات قابـل جـذب توسط گیاه می شوند (3). در نقاط مختلف جهان میکروارگانیسمهای مختلف حل کننده فسفات ایزوله، شناسایی و مورد بهره برداری قرار گرفته اند (2، 6، 7 و 18). باکتریهای حل کنندة فسفات، جذب فسفر به وسیلة گیاه و بازدة محصول را افزایش می‎دهند. بنابراین کاربرد آنها به عنوان کود زیستی مورد توجه محققان قرار گرفته است. این گروه از باکتریها تحت عنوان کلی باکتریهای تشدید کنندة رشد (Plant Growth Promoting Bacteria, PGPB) نامیده می شوند. حل کننـدگی فسفـات به دو دستـه حل کنندگی فسفات معدنی با تأثیر اسیدهای آلی و معدنی کردن فسفات آلی بر اثر فعالیتهای آنزیمی تقسیـم می شود (5 و 10).

استفاده از کودهای زیستی با عرضه کودهای میکروبی در اوایل دهه 1970 شروع شد. این نوع کود از منبع باکتریهای ریزوبیوم که با بقولات زندگی همزیست دارند، تولید شده بود. در اوایل دهه 1980 کاربرد کودهای زیستی در زراعت محصولات دیگری غیر از بقولات اهمیت پیدا کرد و تحقیقات گسترده ای در زمینه کاربرد باکتریهای پیش برنده رشد گیاه ( PGPR) انجام شده و اکنون نیز ادامه دارد. استفاده از کودهای زیستی از جمله کودهای حاوی باکتریهای حل کننده فسفات در راستای کشاورزی پایدار ضمن کاهش مصرف کودهای شیمیایی و افزایش برداشت محصولات کشاورزی به جلوگیری از آلودگی و حفظ محیط زیست کمک می کند (11).

میزان مصرف کود فسفاته در کشور حدود یک میلیون تن با هزینه‌ای حدود 300 ـ200 میلیون دلار برآورد شده است. در سالهای اخیر این مقدار به کمتر از 600 هزار تن کاهش یافته است. تولید و استفاده از کودهای میکروبی جهت افزایش حلالیت و در دسترس بودن فسفات خاک یکی از علل این کاهش است. در این راستا چندین کود میکروبی از جمله بارور 2 تولید و عرضه شده است.

کود زیستی بارور 2 که حاصل نتایج طرح ملی " افزایش میزان فسفات قابل جذب برای گیاه سیب زمینی از طریق معرفی سویه های مناسب میکروارگانیسمها " است (جهاد دانشگاهی، دانشکده علوم، دانشگاه تهران) و اکنون در شرکت زیست فناور سبز تولید و عرضه می شود نمونه موفقی از کودهای زیستی در کشور است. تولید بهینه و مقرون به صرفه این کود مستلزم فرآیند کارآ و بهینه تکثیر و تولید انبوه باکتریهای حل کننده فسفات تشکیل دهنده آن از طریق فرآیند فرمانتاسیون است. آنچه در بهینه سازی فرآیندهای زیستی از جمله تولید انبوه توده سلولی بسیار مورد توجه قرار می گیرد افزایش بهره دهی به منظور کاهش قیمت تمام شده محصول است. مؤثرترین مسیر برای رسیدن به بهره دهی بالا استفاده از کشت با تراکم سلولی بالا است. در این فناوری تعداد سلولهای فعال بر واحد حجم بیوراکتور افزایش می یابد. از آنجایی که بهره دهی کل فرآیند فرمانتاسیون (کل میکروارگانیسم تولید شده در واحد حجم در واحد زمان) متناسب است با تراکم نهایی سلول، برای افزایش بهره وری کل لازم است تراکم سلولی کشت باکتری همراه با حفظ خصوصیات زیستی میکروارگانیسم افرایش داده شود. برای نیل به این هدف از کشت با تراکم سلولی بالا (High Cell Density Culture, HCDC) استفاده می شود (9). استفاده از روشهای HCDC دارای مزیتهای فراوانی از جمله کاهش حجم راکتور، کاهش حجم محیط کشت مصرفی،  تسهیل فرآیندهای پایین دستی، کاهش فاضلاب، کاهش سرمایه گذاری اولیه برای تجهیزات، رسیدن به بهره دهی بیشتر، کاهش قیمت تولید و در نهایت رسیدن به بازده بالاتر می باشد (8).

نخستین گام در افزایش بهره دهی و محصول بیشتر، بهینه ساختن محیط کشت باکتری از نظر تأمین نیازهای ضروری برای رشد و عوامل محیطی مثل pH ، دما و... می باشد. این بهینه سازی از نظر فاکتورهای مؤثر در رشد باکتری، حذف عوامل بازدارنده، کاهش تشکیل مواد سمی و یا کاهش هزینه تولید صورت می گیرد(16 و 17). انتخاب مقادیر مناسب مواد غذایی از قبیل منبع کربن/ انرژی، منبع نیتروژن و عناصر کم مصرف یکی از عوامل موفقیت در تکنیکهای HCDC می باشد.

امکان برقراری کشت با تراکم سلولی بالا با روشهای کشت ناپیوسته، ناپیوسته خوراک‌دهی شده و پیوسته وجود دارد اما به نظر می‎رسد که روش کشت ناپیوسته خوراک‌دهی شده (Fed-batch culture)، روش منتخب برای افزایش تراکم سلولی است. با استفاده از روشهای کشت ناپیوسته خوراک‌دهی شده، امکان رسیدن به مقادیری بیش از 50 گرم وزن خشک سلولی بر لیتر برای باکتری اشرشیا کلی و سایر باکتریها وجود دارد و با پیشرفتهای حاصل در زمینه فنون کشت، امکان رسیدن به تراکمهای بالاتر از 100 گرم وزن خشک سلولی در لیتر نیز فراهم شده است (8 و 14).

هدف نهایی در این تحقیق، توسعه یک روش کشت ناپیوسته خوراک‌دهی شده برای افزایش بهره دهی حجمی در تولید انبوه باکتریهای سودوموناس پوتیدا (P13) و پانتوآ آگلومرنس (P5) مورد استفاده در کود زیستی بارور 2 است. برای این منظور بایستی متغیرهای مؤثر در این فرآیند شامل انتخاب نوع محیط کشت مناسب و طراحی و بهینه سازی محیط کشت و توسعه کشت با تراکم سلولی بالا با حفظ فیزیولوژی سلول مورد ارزیابی قرار گیرند.

مواد و روشها

مواد شیمیایی و زیستی: NaCl, NaOH, NH4OH, K2HPO4, KH2PO4, NH4Cl, Na2HPO4.7H2O, NaH2PO4, (NH4)2 H Citrate, (NH4)2 SO4, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, CaCl2, Na2B4O7.10H2O, (NH4)6MO7O24-4H2O, CuSO4-5H2O, MnSO4.4H2O, CuSO4.5H2O, ZnSO4.7H2O، MnCl2. 2H2O, Zn(CH3COO)2. 2H2O, Fe3 Citrate, (NH4)2HPO4, H3BO3, Na2Mo4.H2O,   Citric acid, EDTA,  

عصاره مخمر، پپتون، آگار، گلوکز، گلیسرول، ضدکف. مواد فوق با خلوص مناسب از شرکتهای مرک و سیگما خریداری شدند.

باکتریها: باکتریهای مورد استفاده در این تحقیق, سویه های سودوموناس پوتیدا (P13) به شماره دسترسی بانک ژن:  EU545412 و پانتوآ آگلومرنس(P5)   به شماره دسترسی بانک ژن: EU545413 هستند که در تحقیقات قبلی ایزوله، شناسایی و تعیین خصوصیات شده اند (10).

محیطهای کشت: تهیه محیط کشت، طراحی و اجرای آزمایشهای بهینه سازی بر اساس تجربیات قبلی در این زمینه انجام شد (1).

محیطهای کشت مورد استفاده برای رشد باکتریها شامل انواع پیچیده (Complex) ، نیمه پیچیده (Semi Complex) و معین (Defined) بودند. از محیط پیچیده,LB)  (Lauria Bertani  برای رشد و محیط شاهد و نگهداری باکتری استفاده شد. این محیط شامل 10 گرم پپتون، 5 گرم عصارة مخمر و 10 گرم نمک طعام در لیتر بود که بعد از رساندن pH آن به 7 در دمای 121 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شد. محیط جامد LB که علاوه بر ترکیبات فوق شامل 15 گرم بر لیتر آگار است، برای کشت باکتری و به دست آوردن کلنی تک باکتری مورد استفاده قرار گرفت.

محلول عناصر کم مصرف (Trace metal): حاوی ,FeSO4.7H2O; 10g ,CuSO4.5H2O; 1g, ZnSO4.7H2O; 2.2g, CaCl2; 2g  Na2B4O7.10H2O; 0.02g ,MnSO4.4H2O; 0.5g, (NH4)Mo7O24.4H2O; 0.1g

در یک لیتر اسیدکلریدریک 5 نرمال است.

 نگهداری باکتریها: برای تهیه و نگهداری ذخیره باکتریایی از محیطهای زیر استفاده شد:

ـ گلیسرول 15 درصد و پپتون 1 درصد برای ذخیره در 20ـ درجه سانتی گراد

ـ گلیسرول 30 درصد و پپتون 1 درصد برای ذخیره در 70ـ درجه سانتی گراد

تهیة مایة تلقیح:  ابتدا از باکتری ذخیره شده در 20- درجه سانتی گراد بر روی محیط کشت جامد کشت داده شد. بعد از بررسی کشت و کلنیها و اطمینان از عدم آلودگی یک کلنی واجد سلولهای مناسب انتخاب و در محیط مایع LB به مدت 18 ساعت  در انکوباتور شیکردار با 250 دور در دقیقه در دمای 30 درجة سانتی گراد گرماگذاری شد. برای کار در مقیاس فلاسک معمولاً 50 میلی لیتر و مقیاس بیورآکتور به میزان 10 درصد حجم محیط کشت فرمانتور کشت بذر تهیه می شد. ظروف به کاررفته برای تهیة بذر طوری انتخاب شد که چهار پنجم آن برای تسهیل هوادهی خالی باشد.

کشت باکتری در مقیاس فلاسک: برای کشت باکتری از 50 میلی لیتر محیط کشت، دمای 30 درجة سانتی گراد و هم زدن با دور 160 دور در دقیقه به مدت 12-16 ساعت استفاده شد. میزان تلقیح بذر به اندازه ای بود که OD600  اولیة کشت به 2/0 برسد.

بهینه سازی محیط کشت با روش آماری تاگوچی: از روش آماری تاگوچی برای بهینه سازی ترکیب محیط کشت استفاده شد. منابع غذایی باکتری به صورت متغیر و شرایط فیزیکی یکسان در نظر گرفته شده است. در این آزمایش 8 متغیر هر یک در 4 سطح بررسی شد. متغیرها و سطوح انتخاب شده در جدول 1-2  ارائه شده است. بنابراین بر اساس آرایه M32 مدل تاگوچی 32 محیط کشت با ترکیبهای مختلف ساخته شده و مورد بررسی قرار گرفتند. هر آزمایش حداقل 3 بار تکرار شد.

جدول1-2 فاکتورها و سطوح مورد ارزیابی

سطح 1

سطح2

سطح3

سطح4

فاکتورهای مورد بررسی

0

10

15

20

A: Pepton           g/l

3

5

10

15

B: KH2PO4             g/l

25/0

5/0

1

2

C: MgSO4              g/l

5

10

15

20

D: Glycerol            g/l

2

5

7

10

E: (NH4)2SO4        g/l

1

2

4

5

F: NaCl                  g/l

0

5/0

1

5/1

G: Trace elements ml/l

0

5

5/7

10

H: Yeast extract      g/l

 

کشت باکتری در مقیاس بیورآکتور: فرآیند ناپیوسته رشد باکتری در فرمانتور 20 لیتری ( شرکت زیست فناور سبز)  با حجم کاری 10-12 لیتر با استفاده از محیط کشت بهینه شده در کشت فلاسک انجام شد. فرمانتور حاوی محیط کشت به مدت 20 دقیقه در 121 درجه سانتی گراد اتوکلاو شده و پس از تنظیم 7 :pH و درجه حرارت 30 درجه سانتی گراد با کشت اولیه تلقیح شد. میزان اکسیژن محلول  (DO) در طول فرمانتاسیون با تغییر دور همزن (500-900 دور در دقیقه) در حد 40 درصد اشباع تنظیم شد. نمونه گیری ساعت به ساعت و اندازه گیری میزان جذب نوری در طول موج nm600 توسط دستگاه اسپکتروفتومتر صورت گرفت. چون در بیورآکتور ابتدا سرعت هوادهی ثابت بود، اکسیژن محلول با افزایش رشد سلولی کاهش می یافت. با پایین تر آمدن DO از نقطه تنظیم شده هوادهی افزایش می یافت. روند بالارفتن میزان هوادهی طوری بود که DO در حدود نقطه تنظیم شده ثابت بماند. در طول فرآیند سرعت همزن نیز تا بالاترین حد ممکن افزایش می یافت. در مواردی که سرعت مصرف اکسیژن بالاتر از مقدار وارد شده بوده و بالاترین سرعت همزن جوابگوی میزان  DO مورد نیاز نبود و سیستم دچار کمبود اکسیژن می شد، مخلوطی از هوا و اکسیژن به فرمانتور تزریق می شد. کف تولید شده در فرمانتور با افزودن ضد کف استریل کنترل شد. اتمام فرآیند از طریق افزایش DO (به دلیل تمام شدن منبع کربن و کاهش مصرف اکسیژن توسط باکتریها) یا pH (به دلیل مصرف منابع نیتروژنی به جای کربنی و تولید ترکیبات آمونیومی) مشخص شده و در این شرایط به فرآیند خاتمه داده می شد.

نتایج

با توجه به اینکه هدف نهایی این تحقیق دستیابی به فناوری تکثیر انبوه باکتریهای سودوموناس پوتیدا (P13) و پانتوآ آگلومرنس  (P5) تشکیل دهنده کود زیستی بارور 2 از طریق توسعة کشت با تراکم سلولی بالا در سیستم کشت ناپیوسته خوراک دهی شده بود، بنابراین ساختار پژوهش به دو بخش تقسیم شده است:

 الف) طراحی محیط کشت و بهینه سازی رشد باکتریها در سطح فلاسک

ب)  بهینه سازی و تولید انبوه باکتریها در فرمانتور

طراحی محیط کشت و بهینه سازی رشد باکتریهای P13 و P5 در مقیاس فلاسک: برای کسب رشد و تکثیر مطلوب باکتریهای P13 و P5  در سطح صنعتی باید محیط کشت مناسب و قابل استفاده در تکثیر صنعتی این باکتریها تعیین شود. با توجه به نتایج اولیه حاصل از کشت این باکتریها در محیطهای معین، نیمه معین و پیچیده (نتایج نشان داده نشده است) و بررسی محیطهای کشت استفاده شده برای جداسازی، شناسایی و رشد باکتریهای سودوموناس و انتروباکتریاسه در تحقیقات مربوطه، تأثیر سطوح مختلف منابع کربن، نیتروژن، ترکیبات معدنی و عناصر کم مصرف بر روی رشد باکتریهای P5 و P13 مورد بررسی قرار گرفته و از این طریق محیط کشت مناسب تعیین شد.

برای دستیابی سریع تر به نتیجه و انجام حداقل آزمایشهای مورد نیاز از روش آماری تاگوچی برای طراحی آزمایشها استفاده شد. در روشهای کسری از فاکتوریل کامل مانند روش تاگوچی، بر اساس تحلیلهای آماری تعدادی از ترکیبهای ممکن بین متغیرها انتخاب شده و پس از انجام آزمایشها، با ارزیابی آماری پاسخهای به دست آمده، بهترین شرایط که حتی ممکن است در بین حالتهای آزمایش شده نیز موجود نباشد، تعیین می‌شود. اگر مطالعه اولیه در تعیین متغیرها و روابط متقابل آنها به دقت صورت گرفته باشد، پاسخ به دست آمده بهترین پاسخ است. در روش تاگوچی زمان انجام آزمایشها به علت کمتر بودن تعداد آزمایش در مقایسه با روش فاکتوریل کامل بسیار کوتاه تر خواهد بود و در مواردی که تعداد عوامل و سطوح آنها زیاد است، ترجیح داده می‌شود.

در این تحقیق، 8 عامل شامل مقدار پپتون ( منبع کربن و انرژی پیچیده)، گلیسرول (منبع کربن معین)، سولفات آمونیوم (منبع نیتروژن معدنی)، عصاره مخمر (منبع نیتروژن آلی)، فسفات پتاسیم، سولفات منیزیم، نمک طعام و عناصر کم مصرف هر کدام در چهار سطح انتخاب شدند (جدول 1-2). سایر شرایط کشت نظیر درجه حرارت (30 درجه)، دور همزن (160 دور در دقیقه) و زمان انکوباسیون (14 ساعت) ثابت بوده و آزمایشها سه بار تکرار شدند. این آزمایشها برای باکتری P13 طراحی و اجرا شد. با توجه به هدف کاربردی و توسعه ای این تحقیق و و شباهتهای تغذیه ای باکتریهای سودوموناس و انتروباکتریاسه نتایج فوق در مورد باکتری P5 نیز بررسی شد.

جدول 1-3  طراحی آزمایش براساس 8 متغیر در 4 سطح که منجر به استفاده از آرایه متعامد M32 روش آماری تاگوچی می شود و میانگین نتایج رشد باکتری P13 بر اساس جذب نوری (OD600) کشت در 3 تکرار را نشان می دهد.

نتایج حاصل از رشد باکتری P13 در 32 محیط کشت با استفاده از نرم افزار Qualitek-4 به روش استاندارد و احتساب میانگین نتایج آنالیز شد.

 

 

جدول  1-3 - ترکیب 32 محیط کشت آرایه متعامد M32 در طراحی آزمایش بر اساس روش تاگوچی و نتایج رشد باکتری P13 در آنها

میانگین رشد OD550

Yeast Extract g/l

Trace ml/l

NaCl g/l

(NH4)2SO4 g/l

Glycerol g/l

MgSO4,7H2O g/l

KH2PO4 g/l

Peptone g/l

شماره آزمایش

159/0±42/2

0

0

1

2

5

25/0

3

0

1

212/0±29/4

5

5/0

2

5

10

5/0

5

0

2

011/0±34/0

5/7

1

4

7

15

1

10

0

3

015/0±27/0

10

5/1

5

10

20

2

15

0

4

068/0±22/4

10

1

4

5

10

25/0

3

10

5

144/0±99/1

5/7

5/1

5

2

5

5/0

5

10

6

23/0±88/4

5

0

1

10

20

2

10

10

7

076/0±16/2

0

5/0

2

7

15

2

15

10

8

12/0±68/5

5/7

5/0

1

10

15

5/0

3

15

9

162/0±35/5

10

0

2

7

20

25/0

5

15

10

055/0±73/0

0

5/1

4

5

5

2

10

15

11

122/0±44/2

5

1

5

2

10

1

15

15

12

15/0±3

5

5/1

4

7

20

5/0

3

20

13

09/0±8/1

0

1

5

10

15

25/0

5

20

14

194/0±98/4

10

5/0

1

2

10

2

10

20

15

127/0±3

5/7

0

2

5

5

1

15

20

16

028/0±23/0

5

1

2

10

5

2

3

0

17

017/0±29/0

0

5/1

1

7

10

1

5

0

18

121/0±57/4

10

0

5

5

15

5/0

10

0

19

055/0±38/0

5/7

5/0

4

2

20

25/0

15

0

20

113/0±97/5

5/7

0

5

7

10

2

3

10

21

0128±45/5

10

5/0

4

10

5

1

5

10

22

02/0±27/0

0

1

2

2

20

5/0

10

10

23

026/0±24/0

5

5/1

1

5

15

25/0

15

10

24

135/0±07/5

10

5/1

2

2

15

1

3

15

25

31/0±79/5

5/7

1

1

5

20

2

5

15

26

011/0±45/3

5

5/0

5

7

5

25/0

10

15

27

141/0±62/2

0

0

4

10

10

5/0

15

15

28

012/0±73/5

0

5/0

5

5

20

1

3

20

29

1/0±20/5

5

0

4

2

15

2

5

20

30

081/0±31/1

5/7

5/1

2

10

10

25/0

10

20

31

168/0±79/2

10

1

1

7

5

5/0

15

20

32

 

 

جدول 2-3 تأثیر سطوح مختلف عوامل مورد بررسی بر پاسخها را نشان می دهد. همانگونه که مشاهده می شود سطوح مختلف عوامل مورد بررسی اثرات متفاوتی بر رشد باکتری P13 دارند. مقادیر افزایشی عصاره مخمر تأثیر مثبت و عناصر کم مصرف تأثیر منفی و یا عدم تأثیر در رشد

 

 

باکتری داشته اند. سایر عوامل در سطوح مختلف تأثیرات متفاوتی روی رشد و تکثیر باکتری P13 داشته اند.

محیط کشت بهینه برای رشد و تکثیر باکتری P13 براساس پیشگویی نرم افزار در جدول 3-3 ارائه شده است که رشد و تکثیر باکتری در آن، براساس جذب نوری، در حدود 9/8 پیش بینی شد.

 

جدول 2-3 تأثیر عوامل مورد بررسی در روش تاگوچی بررشد باکتری P13 در آنالیز با روش استاندارد

                           سطوح

عوامل

سطح 1

سطح 2

سطح 3

سطح 4

A: Pepton                g/l

597/1

123/3

896/3

633/3

B: KH2PO4             g/l

036/4

772/3

566/2

875/1

C: MgSO4               g/l

401/2

141/3

565/3

142/3

D: Glycerol             g/l

673/2

269/3

104/3

202/3

E: (NH4)2SO4         g/l 

847/2

731/3

887/2

784/2

F: NaCl                    g/l

387/3

849/2

735/2

277/3

G: Trace elements   g/l

41/4

992/4

24/2

607/1

H: Yeast extract       g/l

797/1

050/2

224/3

087/4

 

 

جدول 3-3  محیط کشت بهینه (محیط C) بر اساس آنالیز نتایج کشتهای آرایه متعامد M32

                             سطوح

عوامل

سطح بهینه در آنالیز استاندارد(محیط C )

A: Pepton           15     g/l

سطح 3

B: KH2PO4        3     g/l

سطح 1

C: MgSO4          1     g/l

سطح 3

D: Glycerol        10     g/l

سطح 2

E: (NH4)2SO4    5     g/l

سطح 2

F: NaCl               1     g/l

سطح 1

G: Trace elements  0   ml /l

سطح 1

H: Yeast extract  10     g/l

سطح 4

برای بررسی صحت پیش بینی، محیط بهینه پیشنهادی در شرایط یکسان با آزمایشهای قبل مورد آزمایش قرار گرفتند. برای اطمینان از نحوه و خطای آزمایش محیطهای شماره 19 و 24 طراحی آزمایش نیز به عنوان کنترل همراه با محیطهای بهینه مورد آزمایش و بررسی مجدد قرار گرفتند.

نتایج آزمایش رشد باکتری P13 در محیط بهینه به میزان OD600= 6.4± 0.3 را نشان داد. محیط مذکور از نظر ترکیب محیط کشت پیچیده است و اگرچه نتیجه به دست آمده کمتر از رشد مورد انتظار بود اما از رشد باکتری در کلیه محیطهای آرایه متعامد M32 بیشتر بود که برای استفاده در بخش بعدی تحقیق و کاربرد در تولید انبوه باکتری P13 قابل توجه است. با توجه به نتایج محیطهای 19 و 24 که در حدود آزمایشهای قبل است نتایج حاصل قابل اعتماد است و خطای آزمایش قابل توجه وجود ندارد.

برای تعیین سریع محیط کشت بهینه باکتری P5  و انجام حداقل آزمایشهای مورد نیاز، با توجه به نیازهای غذایی مشابه دو باکتری رشد باکتری P5 در محیط کشت فوق مورد بررسی قرار گرفت که نتایج نشان دهنده کسب نتیجه مشابه (OD600 = 6.75 ± 0.46 ) رشد P13 در این محیط کشت بود.

 

جدول 4-3 بررسی تأثیر منبع کربن بر رشد و تکثیر باکتریهای P5 و P13 بر اساس جذب نوری

محیط کشت

مقدار پپتون

گرم در لیتر

باکتری P5

باکتری P13

C1

0

24/6

6

C2

5

80/6

6

C3

10

18/7

2/5

C4

15

12/7

68/5

 

نتایج نشان می دهد که باکتری P5 توان رشد در محیط مذکور را دارد و حتی از رشد بیشتری نسبت به باکتری P13  برخوردار است. با توجه به نتایج فوق محیط C که می تواند رشد هر دو باکتری را در حد مناسبی تأمین کند محیط بهینه و انتخابی برای رشد و تکثیر دو باکتری P5 و P13 در نظر گرفته شد.

اگرچه محیط کشت C حاصل از بهینه سازی توسط طراحی آزمایش رشد خوب باکتریهای P5 و P13 را فراهم کرد اما برای ساده سازی محیط کشت و متناسب شدن آن با شرایط تولید انبوه و صنعتی و کاهش هزینه در فرآیند کشت در فرمانتورو در نتیجه اقتصادی کردن هرچه بیشتر فرآیند،  اثر حذف NaCl که تأثیر زیاد در نتایج نداشت، کاهش منبع کربن پیچیده (پپتون) و افزایش منبع کربن معین (گلیسرول) در رشد و تکثیر باکتریهای مورد نظر بررسی شد. بر این اساس چهار محیط کشت مشتق از محیط بهینه C حاوی 20 گرم در لیتر گلیسرول و مقادیر 0، 5، 10 و 15 گرم در لیتر پپتون مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل در جدول 4-3 ارائه شده است.

همان طور که نتایج نشان می دهد کاهش یا حذف پپتون از محیط کشت تأثیر قابل توجهی بر روی رشد و تکثیر باکتریها نداشت. این تأثیر در رشد دو باکتری کمی متفاوت بود. از آنجا که در انتخاب محیط کشت برای کاربرد در صنعت عوامل مختلف از جمله مشابهت و سهولت تهیه محیط کشت و هماهنگی فرآیند تکثیر دو باکتری برای کاربرد آنها در یک محصول باید در نظر گرفته شود محیط کشت C2 به عنوان محیط کشت منتخب یرای استفاده در فرمانتور و کشت انبوه دو باکتری در نظر گرفته شد.    

بررسی رشد باکتری P5 در بیورآکتور ناپیوسته با استفاده از محیط کشت منتخب

کارآیی محیط کشت انتخابی (C2) در رشد و تکثیر باکتریهای P5 و P13 در فرمانتور 20 لیتری مورد بررسی قرار گرفت. با استفاده از این محیط 9 فرآیند تکثیر باکتریها در فرمانتور با شرایط عملیاتی یکسان مطابق شرایط ذکر شده در بخش مواد و روشها انجام شد.

در مورد باکتری P5 زمان این فرآیندها حدود 8 -6 ساعت بود که منجر به حداکثر تراکم سلولی 1011*6 و جذب نوری حداکثر 7/16، معادل 11.7 گرم بر لیتر وزن خشک سلولی شد جزئیات نتایج رشد باکتری در یک فرمانتور در شکل 3-1 آورده شده است.

 

 

شکل 3-1 نمودار رشد باکتری P5 در فرمانتور ناپیوسته و محیط کشت منتخب

 

شکل 3-2 نمودار رشد باکتری P5 در بیوراکتور ناپیوسته و محیط کشت حاوی 30 گرم در لیتر گلیسرول

 

همان طور که مشاهده می شود استفاده از محیط کشت C2 در فرمانتور منجر به افزایش رشد و تکثیر قابل توجه باکتری نسبت به کشت در فلاسک شده است.

با توجه به نتایج حاصله در شرایط فرمانتور که درجه حرارت، میزان هوادهی، pH، اختلاط محیط کشت و.... تحت کنترل و تقریباً ثابت است باکتری حداکثر استفاده از ترکیبات محیط کشت را کرده و در محیط مشابه فلاسک از رشد بیشتری برخوردار شده است. این نتایج نشان داد که با جایگزینی منبع کربن پیچیده پپتون با منبع کربن ساده ای مانند گلیسرول برای باکتری می توان به رشد خوبی از آن دست پیدا کرد. بر این اساس برای کسب حداکثر تراکم سلولی، منبع کربن و انرژی (گلیسرول) افزایش داده شده و پپتون محیط کشت حذف شد. با افزایش منبع کربن گلیسرول به میزان 30 گرم در لیتر و در شرایط مشابه، رشد بیشتری از باکتری به دست آمد و در زمان نسبتاً کوتاه 5/8 -5/7 ساعت تراکم سلولی بالا ( جذب نوری 25 معادل 17.5 گرم بر لیتر وزن خشک سلولی) با بازدهی 58،0 (گرم توده سلولی بر گرم گلیسرول مصرفی) به دست آمد (شکل 3-2). این نتایج مؤید نتایج حذف پپتون در شرایط فلاسک (جدول 4-3) است.ب

ررسی رشد باکتری P13 در بیورآکتور ناپیوسته با استفاده از محیط کشت منتخب

کارآیی محیط کشت انتخابی مناسب رشد و تکثیر باکتری P5 در فرمانتور در رشد و تکثیر باکتری P13 نیز در مقیاس صنعتی در فرمانتور مورد بررسی قرار گرفت. آزمایشها مطابق شرایط ذکر شده در بخش مواد و روشها انجام شد. با استفاده از این محیط 9 فرآیند تکثیر باکتریها در فرمانتور با شرایط عملیاتی یکسان انجام شد.

زمان این فرآیندها حدود 10- 8 ساعت بود که منجر به حداکثر تراکم سلولی 109*6 و جذب نوری حداکثر 6/18 معادل 14.5 گرم بر لیتر وزن خشک سلولی و بازدهی 0.48 (گرم توده سلولی بر گرم گلیسرول مصرفی) شد. جزئیات نتایج رشد باکتری در یک فرمانتور در شکل 3-3  آورده شده است.

 

 

شکل 3-3 نمودار رشد باکتری P13 در بیورآکتور ناپیوسته با محیط کشت انتخابی B2

 

نتایج نشان داد که باکتری P13 نیز در محیط کشت فوق به خوبی رشد کرده و در شرایط مشابه فرمانتاسیون باکتری P5 به تراکم سلولی قابل توجهی رسیده است. بنابراین این محیط کشت به خوبی نیازهای تغذیه ای و رشد و تکثیر باکتریهای P5 و P13 را تأمین می کند. در شرایط نسبتاً مناسب فرمانتور و محیط کشت نیمه معین در زمان کوتاه و متناسب با شرایط تولید صنعتی تراکم قابل قبول و استفاده ای از باکتریهای مورد نظر به دست آمد.

بحث و نتیجه گیری

کشاورزی پایدار: تولید و بهره برداری مداوم از یک زیست بوم زراعی با رعایت جنبه های مختلف زیست محیطی و اقتصادی بر اساس به کارگیری حداقل نهاده ها ( به غیر از کود آلی ) است. در کشاورزی پایدار برای تعدیل اثر های زیان بار مصرف کودهای شیمیایی فرآیند های زیستی مورد توجه قرار گرفته است. استفاده از کودهای زیستی با عرضه کودهای میکروبی در اوایل دهه 1970 شروع شد. در اوایل دهه 1980 کاربرد کودهای زیستی در زراعت محصولات مختلف اهمیت پیدا کرد و تحقیقات گسترده ای در زمینه کاربرد باکتریهای پیش برنده رشد گیاه ( PGPR) انجام شده و اکنون نیز ادامه دارد. استفاده از کودهای زیستی از جمله کودهای حاوی باکتریهای حل کننده فسفات در راستای کشاورزی پایدار ضمن کاهش مصرف کودهای شیمیایی و افزایش برداشت محصولات کشاورزی به جلوگیری از آلودگی و حفظ محیط زیست کمک می کند (11). کود زیستی بارور 2 نمونه موفقی از کودهای زیستی در کشور است. تولید بهینه و مقرون به صرفه این کود مستلزم فرآیند کارآ و بهینه تکثیر و تولید انبوه باکتریهای تشکیل دهنده آن از طریق فرآیند فرمانتاسیون است.

هدف این تحقیق طراحی و بهینه سازی محیط کشت مناسب برای تکثیر دو باکتری حل کننده فسفات Pantoea agglomerans strain P5 و Pseudomonas putida strain P13 و همچنین تعیین و بهینه سازی شرایط عملیاتی فرآیند فرمانتاسیون با استفاده از محیط کشت بهینه برای کسب حداکثر رشد و تکثیر این باکتریها بوده است.

محیط کشتهای مختلف بر اساس نیازهای غذایی اعم از منبع کربن، نیتروژن، فسفات و عناصر کم مقدار برای رشد مطلوب میکروارگانیسمها طراحی و بهینه شده است. هدف از بهینه سازی محیط کشت دستیابی به افزایش رشد، کسب محصول بیشتر و کاهش هزینه ها است. از آنجا که عوامل مؤثر در محیط کشت زیاد و متنوع و اثر متقابل ترکیبی و پیچیده ای بین آنها و متابولیسم سلولی وجود دارد، غالباً از روشهای طراحی آزمایشها در سطح فلاسک برای بهینه سازی محیط کشت استفاده شده و برای کسب نتیجه مطلوب از نظر حداکثر رشد و تولید محصول نتایج حاصل در سطح فرمانتور ارزیابی و مجدداً همراه با شرایط عملیاتی فرمانتاسیون بهینه می شود (20). رسیدن به تراکمهای سلولی بسیار بالا که باعث کاهش قابل توجه حجم فرمانتورها و امکانات مربوطه و حجم محیط کشت مصرفی می شود از نظر صنعتی و هزینه های تولید بسیار مهم است.

 در این تحقیق روش تاگوچی با توجه به محاسن آن از جمله کاهش قابل توجه تعداد آزمایشها برای بهینه سازی محیط کشت استفاده شد(1). با توجه به نتایج اولیه حاصل از کشت این باکتریها در محیطهای معین، نیمه معین و پیچیده و نیازهای غذایی باکتریهای سودوموناس و انتروباکتریاسه در تحقیقات مربوطه، تأثیر سطوح مختلف منابع کربن، نیتروژن، ترکیبات معدنی و عناصر کم مصرف بر روی رشد باکتریهای P5 و P13 مورد بررسی قرار گرفته و محیط کشت نسبتاً ساده ای برای رشد و تکثیر باکتریها بهینه شد. استفاده از این محیط کشت در فرمانتور منجر به رشد خوب باکتریها در فرآیند غیر مداوم (Batch) شد. در این فرآیند باکتری P5 به تراکم سلولی OD600= 25 در مدت 5/8 ساعت و باکتری P13 نیز به تراکم سلولی OD600= 18.6 در همین مدت رسید که با توجه به پایداری باکتری در شرایط انبارداری روی حامل و سهولت راهبری فرآیند فرمانتاسیون قابل استفاده صنعتی است.

این نتایج قابل مقایسه با موارد مشابه در مورد اشریشیا کلی نوترکیب است (1 و 19). در دو تحقیق انجام شده برای بهینه سازی شرایط رشد و تولید محصول نوترکیب توسط  اشریشیا کلی، تراکم سلولی OD= 19.6 در مدت 10 ساعت با منبع کربن گلوکز به میزان 25 گرم در لیتر (1) و OD=6.6 در مدت 13 ساعت با منبع کربن 20 گرم در لیتر (19) به دست آمده است. کسب تراکم سلولی مشابه و بالاتر در زمان کوتاه تر در این تحقیق کارآیی این فرآیند فرمانتاسیون در تولید انبوه باکتریهای مورد نظر برای تولید صنعتی را نشان می دهد.

محیط کشت بهینه و فرآیند فرمانتاسیون حاصل از این تحقیق هم اکنون در تولید صنعتی کود زیستی بارور 2 استفاده می شود. ضمن اینکه بهینه سازی شرایط عملیاتی فرمانتاسیون غیر مداوم و توسعه فرآیند کشت با تراکم سلولی بالا با روش کشت ناپیوسته خوراک‌دهی شده  می تواند منجر به کسب تراکمهای بالاتر سلولی شود.

سپاسگزاری

این پژوهش در قالب طرح مصوب گروه میکروبیولوژی کاربردی جهاد دانشگاهی دانشکده علوم دانشگاه تهران و با استفاده از بودجه مربوطه انجام شده است.

اجرای بخش طراحی و بهینه سازی محیط کشت باکتریها در آزمایشگاه گروه میکروبیولوژی کاربردی جهاد دانشگاهی دانشکده علوم دانشگاه تهران و بخش فرمانتاسیون آن در شرکت زیست فناور سبز انجام شده است.

از مسئولین و همکاران آزمایشگاه میکروبیولوژی کاربردی و جهاد دانشگاهی دانشکده علوم و مدیریت و همکاران شرکت زیست فناور سبز که با در اختیار گذاشتن امکانات اجرای این طرح را امکان پذیر کردند تشکر و قدردانی می گردد. 

از همکاران گرامی جناب آقای دکتر محمد علی ملبوبی و جناب آقای دکتر سید صفاعلی فاطمی و سرکار خانم دکتر تابنده جهت مشورتهای سودمند و آقای حسن حبیب قمی برای برخی مساعدتهای آزمایشگاهی تشکر و قدردانی می گردد.

 

منابع

 

1- فاطمی سید صفا علی، 1382، تولید ترشحی GM-CSF انسانی در فرآیند کشت با تراکم سلولس بالای اشریشیا کلی نوترکیب. پایان نامه دکتری. دانشگاه تربیت مدرس.

 

2. Bardiya MC, Gaur AC. (1974) Isolation and screening of microorganisms dissolving low grade rock phosphate. Folia Microbiologica.Vol. 19:386–389.

3. Black C.A. (1968) Soil-plant relationships. John Wiley and Sons. Inc. NewYork.

4. Goldstein A.H., Mayfield S.P.,Danon A. (1989) Phosphate starvation inducible metabolism in Lycopersicon esculentum. Plant Physiology, 91:175-152.

5. Halder AK, Mishra AK, Bhattacharya P, Chakrabarty PK .(1990). Solubilization of rock phosphate by Rhizobium and Bradyrhizo-bium. J Gen Appl Microbiology.Vol. 36:81–92

6. Kucey, R.M.N. (1988) Increased phosphorus uptake by wheat and field beans inoculated with a phosphorus-solubilizing Penicillium bilajistrain and with vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi. Appl. Environ. Microbiol. Vol.53: 2699-2703.

7. Kumar T.A., Singh S., Tiwari D.N. (1992) Alkaline phosphatase activities of an Anabaena from deep-water rice. World Microbiol Biotechnol. Vol 8: 585–588.

8. Lee S. Y.(1996) "High cell-density culture of Escherichia coli", Trends Biotechnol. 14, 98-105.

9. Liu C., Muchhal U.S., Raghothama K.G. (1997) Differential expression of TPSII, a phosphate starvation-induced gene in tomato. Plant Molecular Biology. 33: 867-874.

10.  Malboobi M A,  Owlia P,  Behbahani M,  Sarokhani E,  Moradi S,  Yakhchali B,  Deljou A and Morabbi Heravi K. 2009. Solubilization of organic and inorganic phosphates by three highly efficient soil bacterial isolates. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 25:1471-1477.

11. Malboobi M A, Behbahani M, Madani H,  Owlia P, Deljou A, Yakhchali B,  Moradi M and  Hassanabadi H. 2009. Performance evaluation of potent phosphate solubilizing bacteria in potato rhizosphere. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 25:1479-1484.

12. Marschener H. (1986) Mineral Nutrition of higher plants. Academic Press. New York, p426-46.

13. Okusanya O.T., Fawole T. (1985) The possible role of phosphate in salinity tolerance of Lavatera arborea. J Ecology 73:317-322.

14. Riesenberg, D. and Guthke, R.(1999) "High–Cell–Density Cultivation of microorganisms", Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 422- 430.

15- Rodrigues H, Fraga R (1999) Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion. Biotechnol Adv 17:319-339.

16. Rothen S. A., Sauer M., Sonnleitner B and Witholt B (1998). "Growth characteristics of Escherichia coli HB101[pGEc47] on defined medium", Biotechnol. Bioengin. 58, 92-100

17. Seeger, A. Schneppe B., Maccarthy J. E. G. Dechwer W. and Rinas U. (1995) "Comparison of temperature-and isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranoside-induced synthesis of basic fibroblast growth factor in high-cell-density cultures of recombinant E. coli", Enz. Microb. Technol., 17, 947-953

18. Singh S., Kapoor K.K. (1998) Effect of inoculation of phosphate solubilizing microorganisms and an arbuscular mycorrhizal fungus on mungbean grown under natural soil conditions. Mycorrhiza.Vol. 7: 249.

19- Tabandeh, F., Yakhchali, B., Shojaosadati, S A., Khodabandeh, M and Sanati, M. H. 2004. Growth kinetics and human growth hormone production of a heat-inducible recombinant Escherichia coli during batch fermentation. Iranian Journal of Science & Technology, Transaction A, Vol. 28, No. A1:11-17.

20. Weuster-Botz D. (2000) Experimental design for fermentation media development: statistical design or global randomsearch? J. Biosci. Bioeng. 90:473-483.

فسفر یکی از عناصر مهم و ضروری برای رشد و بقاء گیاهان است. کمبود فسفر در میزان رشد و باردهی گیاهان به شدت مؤثر است. برای تأمین فسفر مورد نیاز گیاهان از کودهای فسفره استفاده می شود که در شرایط خاک مقدار زیادی از آن به صورت نامحلول در آمده و از دسترس گیاه خارج می شود. استفاده از کودهای زیستی حاوی میکروارگانیسمهای حل کننده فسفات باعث حل شدن فسفر نامحلول و کاهش مصرف کودهای شیمیایی می گردد. ت